這種共聚焦技術利用激光作為激發光源，將激光聚焦于樣品中的某一點，這樣只有該點附近的區域有熒光，其他沒有被激發的部位沒有熒光，這一區域發出的熒光反射到光電倍增管，在光電倍增管前設有1 個計算機控制的可調節針孔， 保證只有被激發點發出的熒光才能到達光電管，而附近其他點所發出的熒光被擋在視野之外。采用計算機控制激光和針孔， 對細胞內的某一層面進行掃描，可以獲得清晰的二維圖像。

    這一技術成像速度快、自動化程度高。但激光具有單色性，一種激光器只能發出某幾個特定波長的激光，而熒光染料的種類很多，其激發光波長各不相同，這樣在使用某種型號的激光器時，只有少數幾種熒光染料可以使用， 而其他大多數的染料不能使用；目前同時配備數個不同激光器或多光子脈沖激光器的激光共聚焦系統的出現，雖然可以解決這一難題，但是設備結構復雜、價格昂貴，維護保養要求較高。

    這一技術是隨著計算機軟件技術的發展出現的，與激光共聚焦的原理有極大的區別， 它在普通的熒光顯微鏡上加上1 個計算機控制的高分辨率、帶有制冷裝置(以提高信噪比) 的CCD 攝像機， 攝像機獲取的圖像由計算機進行解卷積(deconvolution) 計算， 這種數字式圖像處理可以將聚焦平面以外的圖形信號刪除， 保留高清晰度的焦平面信息。

    這一系統硬件配備比較簡單，價格遠遠低于激光共聚焦系統；由于使用可以發出連續光譜的高壓汞燈或氙燈作為光源，使這一技術幾乎可以用于所有的熒光染料，應用范圍廣泛， 其機械部分組成簡單，靈活性高。這一技術的不足在于其圖像獲取、計算對計算機的依賴性高，圖象獲取時間相對較長，實驗時除要分析的層面被激發外，細胞內其他部位也被激發， 增加了熒光染料的光淬滅，對某些容易被光淬滅的染料會造成明顯的影響；隨著計算機和攝像技術的發展，這些問題也在逐步解決。